HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom.
HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.
HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.
Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka.
Diagram alir HPLC
Pada umumnya windows program HPLC menampilkan urutan dari proses kerja HPLC, terlihat pada gambar (warna hijau) dimulai dari injeksi sampel-pompa(flow eluent)-kolom (terdapat dalam termostat)-detector-proses perhitungan hasil (kromatogram).
Gambar di atas sebagai contohnya.
Mari bro kita pelajari tiap bagiannya…
Injeksi sampel (port injection)
Bagian ini ada yang manual dan otomatis. Tapi disini saya tunjukkan port injection manual. Pada proses ini meliputi tekanan dan flow eluent. Dimana besarnya volume sampel yang diinjeksi hanya sekitar 10 µl, dengan alat penginjeksi yang disebut syringe.
Kolom dan pelarut
Membingungkan!!… (ya benar, itu kesan pertama kali saat kita mempelajari fase dalam kromatografi, untuk itu mari kita mempelajari secara bertahap).
Pada gambar diterangkan bahwa pada analisa kali ini menggunakan perlarut polar. Dimana tiap pelarut dapat diatur perbandingannya secara otomatis. Ex: perbandingan water : acetonitril = 40 : 60 dan setiap analisa, tiap senyawa menggunakan perbandingan yang berbeda. Flow dan preasure dikerjakan oleh pompa, dari mengambil pelarut dalam botol hingga menyalurkan pelarut ke dalam kolom.
Ada dua perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut dan fase diam.
Fase normal HPLC
Ini secara esensial sama dengan apa yang sudah kita baca tentang kromatografi lapis tipis (KLT) atau kromatografi kolom. Walaupun disebut normal, tapi ini bukan merupakan bentuk yang biasa dari HPLC. Dari bagian inilah suatu zat dapat terdeteksi.
Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang/lebih dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.
Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.
Fase balik HPLC
Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air, methanol dan acetonitril.
(ingat bukan air, methanol dan acetonitril biasa, tapi ini khusus untuk HPLC solvent).
Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.
Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom. Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC.
Ini adalah dasar HPLC like disolve like…tolong dipahami lebih dalam!
Termostat
Thermostat dikenal sebagai alat pengatur suhu kolom, di dalamnya terdapat kolom.
Waktu retensi
Mengapa pembahasan waktu retensi saya letakkan di bagian kolom? Karena dari kolom inilah senyawa terpisah pada waktu tertentu (waktu retensi).
Waktu retensi didefinisikan sebagai waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
- tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
- flow pelarut (berpengaruh pada banyaknya pelarut yang melewati kolom)
- kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel)
- komposisi yang tepat dari pelarut
- temperatur pada kolom
Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika kita menggunakan waktu retensi sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa.
Detektor
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.
Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika kita menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, kita akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap.
Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Kita akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.
Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang dibawah 190 nm. Jika kita menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, kita sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut.
Interpretasi output dari detektor
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang kita mengontrol kondisi kolom, kita dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, kita (atau orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.
Kita juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuantitas dari senyawa yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam senyawa tertentu, X.
Jika kita menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, kita tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi kita juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.
Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).
Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama. Misalnya,
Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.
Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika kita mempunyai dua substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), dapatkah kita mengatakan jumlah relatifnya? Kita tidak dapat mengatakannya jika kita menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.
Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil.
Rangkaian HPLC pada spektrometer massa
Ini menunjukkan hal yang sangat menakjubkan! Pada saat detektor menunjukkan puncak, beberapa senyawa sementara melewati detektor dan pada waktu yang sama dapat dialihkan pada spektrometer massa. Pengalihan ini akan memberikan pola fragmentasi yang dapat dibandingkan pada data komputer dari senyawa yang polanya telah diketahui. Ini berarti bahwa identifikasi senyawa dalam jumlah besar dapat ditemukan tanpa harus mengetahui waktu retensinya.
Sumber :
Self & http://www.chem-is-try.org/
